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主题：【原创】化学合成人胰岛素全攻略之一 -- 酸酸
家园 【原创】化学合成人胰岛素全攻略之一 问：你有没有化学/生化本科文凭，或具备相当知识水平？
回答yes者，请继续。
好，你打算做人胰岛素。
而且是化学全合成，绝非捡便宜走捷径利用老妈赠送的胰腺。
为什么？
为了凸现有才，有钱，有瘾，而且，闲得慌。
最重要的是你要指出，全合成牛胰岛素曾经(!)是中国科学界一项伟大的成就，但是，时代进步了, Move ON!
大佬如邢其毅、汪猷或邹承鲁等，都只敢从牛开始。
你直接就做人的，牛吧？(提升新人信心
)先简介胰岛素。
参见
好了，你知道这个伟大科学先辈曾为之伤神，无畏小将为之流血的蛋白分子，其实不过是通过三个二硫键组织起来的两条肽链，而已。
很简单，真的。
那么前辈们的难处在哪里呢？
两点：
1，两条肽链组合的产率太低。这个被邹承鲁先生突破。很了不起，特别要知道那是没有高效液相色谱的岁月...
2，肽链长度，一个21，一个30。直观地看他们要做49个独立的肽键合成、产物分离纯化和鉴定实验。好像也不难哈？慢来，其中每个氨基酸都需要独立地保护、分离纯化。也就是说每一个肽键，他们工作量实际上要平方或者立方一哈...
(虽然最后的离体/活体实验同样重要。你却大可以绕过。你是做化学的，不是饲养员。
)俱往矣。他们用的是液相合成方法。
而你这个走运的家伙，用的将是上个世纪化学界最伟大进步之一：固相合成法。这个方法的基本思路和技术框架是布鲁斯·梅利菲尔德在1962年建立的。
(那时候，梅利菲尔德已经40岁。但是生活，No, 历史，刚刚从40岁开始...
)该思路的核心是要解决合成化学的一个老大难问题：分离纯化。(唔，至少在肽合成方面解决这个问题，布鲁斯的信心很足。)
液相合成里，产物和反应物(总会有一些残余)以及一些废物和副产物都均匀地溶解在一起。如何把产物高效地拿出来，很考察一个化学家的理论水平和实践能力。
梅利菲尔德的思路出奇地简单：什么是最古老而最简便的分离方法？过滤！
如果你的产物都能用过滤拿到，那就没有什么困难可言了。
怎么实现的呢？
想想你淘米的样子，米粒留在筛子上，灰尘砂子被水冲走。
如果，你的肽就是米粒？
太大了，太多了，不现实。你一定要这么说了。
那么，如果你的肽紧紧地贴在米粒上，水冲不走，那就好办多了，对吧？
梅利菲尔德提供了这个思路的关键技术：用什么做担体(就是‘米粒’)，怎样把氨基酸逐次固定到担体上(或者叫缩合)，最后，怎样把合成的肽从担体上切下来。为此，以及他以后二十年里逐渐完善该技术，梅利菲尔德于1984年得授诺贝尔化学奖，位列洛克菲勒诸神。
现在一般把梅利菲尔德方案叫做Boc化学。他用来保护氨基的基团是t-Boc，叔丁氧羰基。
但是，你要用的只是他的思路，而不是这个具体技术。
这是出于对你的关心和爱护。
因为，这个方案的最后一步即把肽切下来那一步，要用到液态氟化氢。液态的，纯的，氟化氢，只能在压力下存在和使用。
请肯定地回答：拒绝。
(认真严肃的化学家在这个方法中找到许多乐趣和独特的应用。但是你尚不需要。)
你要用的是一个叫做Fmoc化学的技术。发明者不可考。
(呃，开玩笑的
。实际是这几个人的名字不大有人提起而已。不要问为什么，否则会触怒神灵...)Fmoc也是用来保护氨基的，中文叫芴甲氧羰基。Boc化学里把氨基去保护是用酸，一般是稀释的三氟乙酸(它的强度跟盐酸很接近，只要严格操作就不危险。不要看见氟这个字就跑。)。而Fmoc化学里去保护步骤要用的是一种有机碱，哌啶(Piperidine)。
一阴一阳，是不是？而到了最后一步，Fmoc的优势就显出来了，它只要求浓度大约90%左右的三氟乙酸。不需要压力，没有毒性(相对非常小)。由于在技术上的等价性和使用上的方便，面向应用的化学家以及多数合成工业都偏好Fmoc化学。
另外两步即担体和缩合，其技术细节上两个方案也是不同的，不过不值得花太多时间。
接下来，你需要制定一个采购清单。
本帖一共被 1 帖 引用 (帖内工具实现)家园 花催下文 家园 来西西河就一个感觉..这些老大非呛死我不可 
家园 【原创】化学合成人胰岛素全攻略之二 做合成化学嘛，无非还是那两类必备物品：仪器和试剂 (地球人都知道的废话！
)先说简单的：仪器。
如果你看过邹承鲁先生的回忆录，大概你的第一反应是：自动合成仪嘛！虽然，你心里很有把握地肯定，你并不真的知道那是什么玩意儿。
所以，还得从简单的说起，即手工合成用的仪器。
(哦，手工合成实际上一点都不比自动仪来得慢，向毛主席保证！...如果，你只需要合成一个或几个肽。这是后话。)
固相合成是梅利菲尔德发明的，他自然也设计了相应的玻璃仪器。
这就是一个典型的由Pyrex制造的多肽合成反应器，取自Sigma-Aldrich技术文档。它比梅利菲尔德的原设计多出上面那个开口和滤芯。
外链图片需谨慎，可能会被源头改前面说了，梅利菲尔德思路的核心是用过滤这个办法来尽可能地简化一切分离提纯步骤。如何简单、快速、可靠地过滤自然是第一位的设计目标。拿这个瓶子来说，它用的是烧结玻璃滤芯，材料惰性，耐磨(因为玻璃硬度大)，滤速快且基本无沾留。实际上所有固相合成用的过滤材料都必须符合这些基本条件。这个瓶子的另一个好处是比较容易实现密封和加/取样品。以后就用它为例做具体说明。
你还需要一些辅助器材，比如说，锥形瓶，量筒，滴管。你在中学化学实验里就用过。
另外，你也需要实验室真空系统、天平等等常规设备。
一个很顺手而且大概必不可少的东西是高压氮气瓶。它是过滤时的主要动力。当然，你要有氦气或者氩气也可以。原则是必须惰性和具有一定压力。(不用压力当然也可以有效地过滤，只是整套仪器和做法都要大改。)
那你说了空气泵干嘛不行？或者干脆用个大大的汽车内胎？
...也行
不过给合成过程带来很多限制。没骗你吧？这比多数大学化学实验室的仪器设备都要来得简单。
接下来说这个很麻烦的试剂采购。
你肯定已经盘算出来，首先要买的是氨基酸。氨基酸缩合而成多肽嘛。
主要的化学试剂经销商一般都出售你所需要的氨基酸，价格不同而已，产品质量差别不大。
因为...很多是在中国生产的
。具体买什么呢？
先来看看你需要做什么。前面提到过，胰岛素是两条肽链组成的。你需要做的就是先分别合成两条链：
A链：(氮端)GIVQQCCTSICSLYQLENYCN(碳端)
B链：(氮端)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(碳端)
天然20种氨基酸，只有三种你用不上：D,M和W。
就是说，其他你都需要买。
需要买多少呢？
这有个简单的规则：按摩尔计，你要做多少肽？
你要说了：1个摩尔？或者干脆10摩尔，好算点。
...呃，摩尔这个计量单位是很大的。考虑到胰岛素的分子量接近六千道尔顿，10摩尔胰岛素就将近60千克了！
所以请接受这个推荐值：0.1毫摩尔。(实验室用化学/生物方法人工合成的蛋白都是在纳摩尔至毫摩尔这么个数量级范围。)
记下这个数，乘上2再乘上每种氨基酸出现的次数。比如C出现6次，就乘6。这是你购买每种氨基酸的下限(按摩尔计)。乘以30再乘上每种氨基酸出现的次数，这是你购买量的上限。多数情况下，氨基酸都是按单位重量标价，1克，5克，20克，等等。你就需要把你的摩尔数值换算成质量数值(不要说你不会算
)。要记住这些是预算数量，为了弥补实验过程中的意外，多准备一些没有坏处。前面说了，你要用的是Fmoc化学。Fmoc是保护氨基的。不巧的是，很多氨基酸除了用以串成肽链的一个氨基和一个羧基，还有第二个氨基或者羧基，或者羟基，等等活泼基团。这些，也是需要保护起来的，而保护手段必须在合成过程中稳定，在最后切肽时又能被去掉。好在都已经有非常成熟的产品。
按照上面说的，去找你要的氨基酸单体吧。
(你算完了？明白按重量计价的原因了吧？
)现在你就可以给你中意的经销商打电话了。告诉他们，你需要兼容Fmoc化学的、三氟乙酸(TFA)可切的氨基酸，17种。第一种是...第二种，是...
除了氨基酸，你当然还需要合成试剂。这方面花样很多，各有侧重。实际上这是目前还在继续发展的一个方向。
成熟的主要有两类，选一类就可以了：1，哌啶+HOBt/DCC或DIC。2，哌啶+HBTU或HATU/HOBt/DIEA。数量呢，要你上面选中的摩尔数值的总和的2至3倍。(多乎哉？不多也。)
这都是些什么哦？你要问了。
不要急。先买到手，有的是时间刨根问底。经销商听得懂你要什么，这都是很标准的缩写。
接下来订购切肽试剂：苯甲硫醚，二巯基乙烷，苯酚，三异丙基硅烷。各有5克就差不多了。(这些试剂过于普通，量太少了人家不卖。)
然后是反应溶剂，记下这个几个名字：DMF,NMP，二氯甲烷，各买8升。乙醚(或甲基叔丁基醚)，三氟乙酸各买1升。
最后，也是很重要的，固相合成嘛，你需要这个‘固相’。成熟方案的固相担体多是基于树脂小球的。
这里有个小小的细节: 你一定要买一种叫做Wang树脂的。
Why?你又问了。
先买了再说。
所有合成用的树脂都是特别制作的，虽然原材料很普通，无非聚苯乙烯，聚乙烯之类的。但是既然要能把氨基酸固定上去，树脂表面必须经过活化处理。特别之处就在于这些活化点必须与Fmoc化学(或者Boc化学)兼容。这个是经过了20-30年的研究才成熟的，而且目前仍然比较热门。
对了，差点忘了，Wang树脂的一个好处是厂家一般已经把第一个氨基酸给你固定上去了，省你不少事。所以你要买这两种Wang树脂：Fmoc-Asn(Trt)-Wang树脂和Fmoc-Thr(tBoc)-Wang树脂。
如果你仔细想一下，任何树脂表面的活化点显然都是有限的。这个单位重量树脂的活化点的数量，叫做它的取代度。不同批次制造的树脂的这个数值都不同，经销商会告诉你他的库存树脂的取代度是多少。看出来了吧？这个取代度决定了你用某特定重量的树脂得到的合成产量的上限。
既然你已经决定你要合成多少A和B链，并且经销商又告诉你什么样的树脂各有什么样的取代度，你需要多少树脂呢？不需要别人替你算了吧?
知道你很有钱，但是经销商是不是有现货，是不是能按时发货，就不是你能决定的了。
假设这一切顺利，你就要动手了...
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家园 很涨知识的说~ 持续跟踪之~希望更加详细的介绍科普知识啊~
家园 作为化学盲，生物民工路过，飘过，闪过，表示无视。。。 都这年代了，用细菌，细胞表达就是了，完全人工吗。。。。一个牛细胞，人细胞都不要。。。哈哈
家园 九几年陈章良还在到处讲做重组胰岛素如何如何能赚钱 不知道现在国内有没有做的。其实细菌发酵做这玩意技术真是很简单的。
家园 呵呵 给讲讲细菌发酵呗？
- 复 呵呵
家园 那个很简单的 就是做个质粒，把基因放上去，然后转到大肠杆菌或者酵母里面，加抗生素加营养通氧气猛摇，过一晚上，出来的胰岛素能卖的价钱能让你乐开花。
要搞成工业化的连续发酵没这么简单拉。在产物本身可以表达的前提下，要维持细菌的生长条件一般需要采用生物反应器，这个东西能控制发酵的温度，pH,供氧，养料供给等等，这个需要一点投资，菌种保持要一点点技术，还有大量的蛋白纯化需要一定的技术条件。这是说你想做成正经的规模生产，小本经营的话，做不连续的中小型发酵，采用实验室常规的蛋白提纯设备，100万块人民币设备费差不多就够了。从生物技术上讲，用微生物生产这样的不需修饰，只有两个二硫键的超小型蛋白，是不存在什么大技术障碍的。
真正的障碍可能还是在融资，管理，过药检，成本控制，营销这些方面。我查了一下，以供研究用的胰岛素为例，现在从牛胰腺里提取的胰岛素，大概是因为来源丰富吧，一毫克大概只卖1美元，按这个价格，用微生物发酵方法来生产胰岛素，成本控制可能比较困难。比如说，一般用大肠杆菌做蛋白，一升培养基一般可以做出20－100毫克，这种小蛋白可能表达好一点，打它能表达100mg吧，那市场价就是100美元，每升普通的培养基成本大概5美元左右，从这儿看起来是不错，但是考虑到人工和设备投资，尤其是蛋白纯化用到的试剂和耗材都比较贵，这个里面的利润空间我觉得还是比较有限的。