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主题：【原创】化学合成人胰岛素全攻略之一 -- 酸酸
问：你有没有化学/生化本科文凭，或具备相当知识水平？
回答yes者，请继续。
好，你打算做人胰岛素。
而且是化学全合成，绝非捡便宜走捷径利用老妈赠送的胰腺。
为什么？
为了凸现有才，有钱，有瘾，而且，闲得慌。
最重要的是你要指出，全合成牛胰岛素曾经(!)是中国科学界一项伟大的成就，但是，时代进步了, Move ON!
大佬如邢其毅、汪猷或邹承鲁等，都只敢从牛开始。
你直接就做人的，牛吧？(提升新人信心
)
先简介胰岛素。
参见
好了，你知道这个伟大科学先辈曾为之伤神，无畏小将为之流血的蛋白分子，其实不过是通过三个二硫键组织起来的两条肽链，而已。
很简单，真的。
那么前辈们的难处在哪里呢？
两点：
1，两条肽链组合的产率太低。这个被邹承鲁先生突破。很了不起，特别要知道那是没有高效液相色谱的岁月...
2，肽链长度，一个21，一个30。直观地看他们要做49个独立的肽键合成、产物分离纯化和鉴定实验。好像也不难哈？慢来，其中每个氨基酸都需要独立地保护、分离纯化。也就是说每一个肽键，他们工作量实际上要平方或者立方一哈...
(虽然最后的离体/活体实验同样重要。你却大可以绕过。你是做化学的，不是饲养员。
)
俱往矣。他们用的是液相合成方法。
而你这个走运的家伙，用的将是上个世纪化学界最伟大进步之一：固相合成法。这个方法的基本思路和技术框架是布鲁斯·梅利菲尔德在1962年建立的。
(那时候，梅利菲尔德已经40岁。但是生活，No, 历史，刚刚从40岁开始...)
该思路的核心是要解决合成化学的一个老大难问题：分离纯化。(唔，至少在肽合成方面解决这个问题，布鲁斯的信心很足。)
液相合成里，产物和反应物(总会有一些残余)以及一些废物和副产物都均匀地溶解在一起。如何把产物高效地拿出来，很考察一个化学家的理论水平和实践能力。
梅利菲尔德的思路出奇地简单：什么是最古老而最简便的分离方法？过滤！
如果你的产物都能用过滤拿到，那就没有什么困难可言了。
怎么实现的呢？
想想你淘米的样子，米粒留在筛子上，灰尘砂子被水冲走。
如果，你的肽就是米粒？
太大了，太多了，不现实。你一定要这么说了。
那么，如果你的肽紧紧地贴在米粒上，水冲不走，那就好办多了，对吧？
梅利菲尔德提供了这个思路的关键技术：用什么做担体(就是‘米粒’)，怎样把氨基酸逐次固定到担体上(或者叫缩合)，最后，怎样把合成的肽从担体上切下来。为此，以及他以后二十年里逐渐完善该技术，梅利菲尔德于1984年得授诺贝尔化学奖，位列洛克菲勒诸神。
现在一般把梅利菲尔德方案叫做Boc化学。他用来保护氨基的基团是t-Boc，叔丁氧羰基。
但是，你要用的只是他的思路，而不是这个具体技术。
这是出于对你的关心和爱护。
因为，这个方案的最后一步即把肽切下来那一步，要用到液态氟化氢。液态的，纯的，氟化氢，只能在压力下存在和使用。
请肯定地回答：拒绝。
(认真严肃的化学家在这个方法中找到许多乐趣和独特的应用。但是你尚不需要。)
你要用的是一个叫做Fmoc化学的技术。发明者不可考。
(呃，开玩笑的。实际是这几个人的名字不大有人提起而已。不要问为什么，否则会触怒神灵...)
Fmoc也是用来保护氨基的，中文叫芴甲氧羰基。Boc化学里把氨基去保护是用酸，一般是稀释的三氟乙酸(它的强度跟盐酸很接近，只要严格操作就不危险。不要看见氟这个字就跑。)。而Fmoc化学里去保护步骤要用的是一种有机碱，哌啶(Piperidine)。
一阴一阳，是不是？而到了最后一步，Fmoc的优势就显出来了，它只要求浓度大约90%左右的三氟乙酸。不需要压力，没有毒性(相对非常小)。由于在技术上的等价性和使用上的方便，面向应用的化学家以及多数合成工业都偏好Fmoc化学。
另外两步即担体和缩合，其技术细节上两个方案也是不同的，不过不值得花太多时间。
接下来，你需要制定一个采购清单。
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看不懂也花
有时间我把Sanger的测序部分给补上。
都这年代了，用细菌，细胞表达就是了，完全人工吗。。。。一个牛细胞，人细胞都不要。。。哈哈
早期合成活性蛋白的一个目的是为了推广多肽合成的应用和发现并改进合成方法里面的问题，所以成功完成了含有上百个氨基酸的蛋白的合成。而今天这个技术已经完全成熟，化学全合成蛋白这个方向就退居次要地位。
但是，对于某些在细菌中表达极其困难，或生化方法分离效率极低，但是又极其重要的靶标蛋白，化学合成是不可或缺的。
参见：
HIV-1 Protease和它的旋光对映体的全合成与结晶
RC Milton, SC Milton, and SB Kent
Science 5 June 1992 256: 1445-1448
Structure of complex of synthetic HIV-1 protease with a substrate-based inhibitor at 2.3 A resolution.
Miller M, Schneider J, Sathyanarayana BK, Toth MV, Marshall GR, Clawson L, Selk L, Kent SB, Wlodawer A.
Science 1 December 1989 246: 1149-52
不知道现在国内有没有做的。其实细菌发酵做这玩意技术真是很简单的。
想当初他和他老婆还是有料的，九十年代初俺大学毕业，差点去他们的夫妻老婆店。后来同学父母劝阻，说这俩太黑，现在看来不假。当时同学父母的是二医附属瑞金的院长和书记的同班同学，而且也是科主任一级，所以对他们俩的那个血液研究所里的猫腻还是很清楚的。他们俩压榨得太厉害，而自己又开始脱离实际。所以到新世纪，他们开口说出来得，还是十几年前得行情，听着就越来越好笑了。可惜啊，挺聪明的人钻到官场钱眼里。。。
给讲讲细菌发酵呗？
就是做个质粒，把基因放上去，然后转到大肠杆菌或者酵母里面，加抗生素加营养通氧气猛摇，过一晚上，出来的胰岛素能卖的价钱能让你乐开花。
要搞成工业化的连续发酵没这么简单拉。在产物本身可以表达的前提下，要维持细菌的生长条件一般需要采用生物反应器，这个东西能控制发酵的温度，pH,供氧，养料供给等等，这个需要一点投资，菌种保持要一点点技术，还有大量的蛋白纯化需要一定的技术条件。这是说你想做成正经的规模生产，小本经营的话，做不连续的中小型发酵，采用实验室常规的蛋白提纯设备，100万块人民币设备费差不多就够了。从生物技术上讲，用微生物生产这样的不需修饰，只有两个二硫键的超小型蛋白，是不存在什么大技术障碍的。
真正的障碍可能还是在融资，管理，过药检，成本控制，营销这些方面。我查了一下，以供研究用的胰岛素为例，现在从牛胰腺里提取的胰岛素，大概是因为来源丰富吧，一毫克大概只卖1美元，按这个价格，用微生物发酵方法来生产胰岛素，成本控制可能比较困难。比如说，一般用大肠杆菌做蛋白，一升培养基一般可以做出20－100毫克，这种小蛋白可能表达好一点，打它能表达100mg吧，那市场价就是100美元，每升普通的培养基成本大概5美元左右，从这儿看起来是不错，但是考虑到人工和设备投资，尤其是蛋白纯化用到的试剂和耗材都比较贵，这个里面的利润空间我觉得还是比较有限的。
那活儿其实是一个叫唐建国的人干的，国内有卖重组胰岛素的，但不是北大出来的。
持续跟踪之~希望更加详细的介绍科普知识啊~