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主题：新冠肺炎诊断标准（第一版1.16前）的逻辑困境 -- 惊蛰
家园 效率高的是临床诊断，后来用了。 张笑春建议用CT表现还筛选，很正确的，后来也采纳了。传染病就这样，有几个选错了不要紧，关键别漏掉了。漏掉的出去，到处传染，控制不住 的。应收尽收，应治尽治，是正路。
通宝推：唐家山,家园 血清学检测，是我的临床药学的朋友的思路 病毒在人体脏器内急剧增殖，肯定会脱落进入血管到达外周血中，跟检测乙型肝炎的活动期一样，血液中有病毒颗粒存在，能检查到“表面抗原”或者“核心抗原”。最后怎么表征这个病毒？还是要用核酸检测。鼻咽部擦拭子检测，因为病毒进入人体就下潜到肺底部，擦拭子上没有病毒会漏检，搽拭子上病毒颗粒如果太少，在洗脱收集的过程中的再丢失也会导致漏检。
我这位朋友，却是高福的同情者，他认为临床核酸检测，早期近乎一半的假阴性，漏过的病患放回到日常生活中，成为一个个传染源，非但传给同事和亲友，连医院的非传染科的医护都大量感染。高福事前也不可能知道如此高的假阴性，然而正是这个假阴性，混合于冬季感冒高发期导致的普通发热（高噪音），导致了湖北被打崩的后果。
这正是我觉得论文主导者居高位者的思路根本不足以应对突发性烈性传染病管理与防控，他们这类人对防疫的敏感性，远远小于那些被胸片吓得要死的一线医生。普通的感冒病毒，即便引发肺炎，也不足以造成如非典那样的典型胸片。CDC的现任掌舵者们，很有可能没有从临床的角度去思考，发热引发的肺炎一下子扫倒很多人，甚至包括医护，他们的胸片都显示高度异常，居然也没引发管理者们的警惕。以后的CDC主导者，看来会加一个硬制约：没有高水平的临床经验者无缘。
作为直接管理者，竟然有反科学的古怪思维逻辑，而一旦说过“I approve this message”进行背书，往后的责任你怎么洗也洗不掉了。所以河友说高福现在是在拼命找一口小一点的锅，符合逻辑：锅背不好，可要遗臭万年了，只要后辈们说起来，自己就会作为反面典型被揪出来批判。
家园 假如没有以后了... 这个病毒是人造的。
造这个病毒的技术可以进一步提高。
有势力存心想灭绝某部分人类，而且他们是掌握解药的。
所以他们并不慌乱。
他们为了做这件事情，已经谋划了很多年了。
偏偏在天朝蒸蒸日上的关键时刻，
偏偏在春运季节，
偏偏在九省通衢的wuhan，
偏偏这个城市有野生动物市场，有病毒所。
这么多巧合，要说没有阴谋，
打死我也不信啊。
再联系到19年的猪流感，还有17年前的SARS，
还有突然离奇去世的加拿大病毒学家 Frank Plummer。
凡此总总，说明他们并不怕世人知道自己的计划。
因为他们的实力足够强大，而且还有下一阶段的计划。
现在天朝已经事实上与多数国家断绝了贸易往来，人员往来。
要小心他们实行下一步的计划了：诱发病毒变异，或者释放新版本病毒。
家园 你和“你的朋友”就是坏事的那种人 你和“你的临床药学的朋友”知道出一个血清学检测抗体要多少时间么？
时间也不长，应急攻关也就四个星期吧……
所以钟南山那边现在才刚刚做出来，也只是做出来而已，还没完成一致性检测，而且还要测试当时选择的抗原表位的优劣。血清学检测的灵敏度和一致性更是个大问题，正常血清学检测光一个方法稳定下来就要折腾可能10年的时间。不开玩笑，血液检测单上的每一个指标背后那个数字都能发好几篇顶级医学杂志。
你和“你的临床药学的朋友”一无所知，所以才能这么轻飘飘地讲话
家园 先看看这个是否效率更高，请继续评论 欢迎探讨和转发
【关于从患者血清中直接扩增 2019-nCoV 序列的思考】
两由之 2020-02-12
由于 2019-nCoV 核酸定量 PCR 出现高达 55%左右的假阴性 国家卫健委对于这次武 汉新冠肺炎的诊断标准进行了第六次改版，肺部的改变和发热作为新冠肺炎的主要诊 断标准，把定量 RT-PCR 的结果只作为参考标准。为什么定量 RT-PCR 出现如此多的 假阴性?如何提高 2019-nCoV 序列的检出率?这是必须要面对的两个主要问题。在抗 疫的初期，由于过度依赖 RT-PCR，放过了大量的隐形感染者，不得不说，后续的大 爆发和这个老百姓说的核酸诊断过多的假阴性有关。
定量 RT-PCR 的结果假阴性的原因是多方面的:
1. 取样的类型部位和时间点:一般而言，肺泡灌洗液效果最好，然而操作复 杂，需要富集病毒;鼻拭子/咽拭子是最常用的方法，但如果病毒负荷低， 很难得到阳性结果;
2. 样品 RNA 提取操作过程中病毒颗粒丢失:如果样品里仅仅只有几个拷贝的 病毒，高损失率的 RNA 提取方法会大大地丢失病毒颗粒;
3. 反转录的效率低下;
4. 扩增的循环数不够;
5. PCR 长度/引物设计/引物的特异性。
如果直接用肺泡灌洗液/鼻拭子/咽拭子进行 PCR, 由于有大量的粘液，分泌物，不适 合用于直接 PCR.
在武汉新冠肺炎爆发初期，报道说每天只能筛查 200 多病人，而今估计检查 2000 病 人没有问题，但这个检查的作用已经渐渐推到次要地位。如何提高核酸检查的阳性 率，是摆在我们科研人员面前的当务之急。
【病毒 PCR 扩增区】
经过仔细研究，比较，我挑选了 4 段 2019-nCoV 的核酸序列作为 PCR 的靶序列，这 四个片段长度都在 200bp 以内，位于病毒的 Spike 蛋白区，与其他冠状病毒/细菌/人 体基因组无交叉，建议设计新的引物和探针，optimize 后，用于一线检测。这四段序 列如下:
片段一 (Spike 区):
GACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTA 23646 CACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAAT 23689
片段二(Spike 区): GCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATA 21645 CACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTT 21705 ACATTCAACTCAGGACTTG 21724
片段三(Spike 区): CACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTG 22240 GTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA 22300 AGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAG 22331
片段四(Spike 区): TCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGG 23661 TGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTAT 23721 TAGTGTTAC 23730
【关于从患者血清采样】
WHO 的资料表明，MERS 冠状病毒感染，早期就在血清样品中扩增到病毒片段;很多 文献研究发现，猫感染猫科冠状病毒后，血清里也可以用 PCR 扩增出病毒片段。同样， 其它病毒感染，如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)感染患者血清，也 可以在早期查出病毒。2003-2004 的 SARS 爆发，也有采集血清做 PCR 的报道。
越来越多的证据表明，武汉新冠肺炎的病人，在感染的早期，就经历了病毒血症，在后 期病毒血症引起多器官功能损害，病毒性心肌炎更是常见并发症和死亡原因之一。病毒 感染呼吸道上皮后，大量病毒复制，很快进入血液。因而，采集血样做病毒核酸 PCR， 可以极大限度减少医护人员的工作量，减少因为操作而传染的危险性。
血样采集后，放到 1.5 毫升 Eppendorf 管，离心后取血清，直接进入 RT-PCR. 余下的 血清备用，或用于抗 2019-nCoV IgM 检测。
【关于直接进行反转录 PCR】
由于本人不是从事病毒学研究，手上没有实际病毒操作数据。我只能根据以往直接的经验，草 拟一步法反转录 PCR。
1. 制备一步法 RT-PCR 反应混合物 (包含 1μl 反转录酶，1μl 100nmol 上游引物和下游 引物，1μl 0.1M DTT, 4μl 5X RT Buffer, 1μl RNase out, 10μl Heat-start Taq-SyberGreen reaction mixture (containing Taq/dNTP/PCR buffer and MgCl);
2. 加入患者血清 2ul, 混合均匀;
3. 反应步骤如下:
A. 25°C5min;50°C40min,95°C10min B. 95°C8s,57°C4s,72°C6s,40cycles. C. Meltingcurvefrom65°Cto95°C.
4. 分析PCR结果，如果溶解曲线正常，CT值33.3定义为一个拷贝，30为十个拷贝， 26.66 为 100 拷贝，余此类推。
家园 乱弹琴 做核酸检测，首先要做的就是判断引物和探针区域的保守性，这就是为什么CDC取了ORF1ab和N的原因。这里居然用最不保守的Spike区域，一开始就错了，写得越多错的越多，毫无讨论的价值
家园 上下文看 http://m.kdnet.net/share-13587952.html
中提到的卫健委，是省/或者市卫健委。
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家园 根上的缘由 根上的缘由还是不在乎底层意见，不愿意听底层建议。
一线临床医生一而再，再而三的反应，置若罔闻。
顶层设计状态下只需要有指那打那干活的手就行了。